葉綠素的熒光光譜測量

實驗背景：「葉綠素」的光學(xué)知識

       葉綠素是植物從光中吸收能量所需的基本色素。它在可見光譜的藍(lán)色和紅色部分吸收光較強，在可見光譜的綠色部分吸收光較弱，這使它在人的肉眼中成為可識別的綠色。

       葉綠素的檢測可以追溯到19世紀(jì)早期，1817年Joseph Caventou和Pierre Pelletier將其分離出來。后來，利用了立體化學(xué)、核磁共振、光學(xué)和質(zhì)譜等方法檢測了分子的元素組成和一般結(jié)構(gòu)。

要確定葉綠素濃度，其中一種方法就是測量其熒光發(fā)射率。葉綠素在650-800 nm范圍內(nèi)可以檢測到熒光，再通過測量700 nm和735 nm左右波長的熒光發(fā)射峰值，計算它們的比值，可以推導(dǎo)出葉綠素含量的線性關(guān)系。

葉綠素的存在是植物呈現(xiàn)綠色的原因，而缺乏葉綠素會導(dǎo)致葉子的顏色變成紅色或黃色。基于這一點，我們使熒光發(fā)射峰值更高，從而得到葉綠素濃度更高的綠色一品紅葉。

本實驗將過比較不同顏色一品紅(紅、綠、白)葉片的熒光光譜，測定其葉綠素濃度。

圖1 用于實驗的一品紅植物

溶解在甲醇中的紅色葉片樣本(左)，綠色葉片樣本(中)和白色葉片樣本(右) 

此外，我們還將測量一個白色一品紅片樣本，對比其與紅色和綠色葉子樣本的葉綠素濃度。測量時，每一片葉子都被溶解在甲醇中，以便從每個樣品中分離并提取葉綠素(圖1)。

實驗系統(tǒng)：

本實驗的系統(tǒng)如圖所示(圖2)。光譜儀使用的是AvaSpec-ULS2048CL-EVO，該設(shè)備擁有新的光譜學(xué)技術(shù)。這款光譜儀提供USB3.0通信，速度是USB2.0的10倍，使用了CMOS探測器，AS-7010電路板，這款電路板上可以存儲更多的光譜，實現(xiàn)更多功能。此外，這款光譜儀可以定制狹縫尺寸，光柵，光纖入口和連接器，以滿足各類應(yīng)用需求。

圖2：葉綠素測量實驗裝置

其他用于實驗的配件有單色儀, 用于過濾特定波長光源,以確保只有所需觀察的發(fā)射光譜。比色皿支架(CUV-DA)，可以使樣品暴露在較大的光量下。一個比色皿遮罩 (CUV-COVER-DA)，用來減少環(huán)境光的影響。600微米纖芯光纖(FC-UVIR600-1-BX)，用來連接光譜儀和比色皿。三個樣品(紅葉樣品、綠葉樣品和白葉樣品)都放入比色皿中測量。

實驗方法及數(shù)據(jù)：

每個葉片樣本溶解在約30ml的甲醇中，將存有樣本的溶液在120°C的加熱板上加熱1分鐘來提取葉綠素，再將混合溶液移入比色皿中進(jìn)行分析測量。將單色儀直連到AvaLight-Hal-S-Mini上，接著在不同波長之間循環(huán)測試，直到找到能使樣品達(dá)到亮度較大的波長，此激發(fā)波長為620 nm處。

數(shù)據(jù)分析模塊，我們使用了AvaSoft的Sd模式，AvaSoft是我們定制的軟件包。Sd模式是測量熒光的常用模式。因為Sd模式從每個波長的原始計數(shù)(即范圍模式)中減去暗背景光譜(光譜儀在沒有光源的情況下測量的光譜)。這有助于減少光譜中的噪聲，并更好地隔離發(fā)射峰。

調(diào)整積分時間可以增加或減少一次測量的光量，這會影響結(jié)果光譜的整體幅度大小。平均次數(shù)表明兩個值被平均在一起，可以提供更一致的光譜結(jié)果。實驗時，我們將積分時間設(shè)為9秒，平均值設(shè)為2。此外，我們用試管支架蓋覆蓋了所有樣品，以確保測量的光來自光源，避免環(huán)境光的影響。

實驗結(jié)果分析：

圖3：紅色一品紅樣品的熒光光譜

發(fā)射峰在673.90 nm和722.84 nm

圖4：綠色一品紅樣品的熒光光譜

發(fā)射峰在687.17 nm和730.87 nm

圖5：白色一品紅樣品的熒光光譜

發(fā)射峰在675.63 nm和726.28 nm

紅色一品紅葉片樣品的熒光光譜測量到的發(fā)射峰在673.90 nm和722.84 nm(圖3)。這符合與文獻(xiàn)報道中所描述的的：葉綠素發(fā)射峰在650-800 nm之間。

綠色一品紅葉片樣品的熒光光譜在687.17 nm和730.87 nm處顯示更高的發(fā)射峰(圖4)。與紅色葉片樣品相比，這兩個峰略高，但仍與文獻(xiàn)報道所描述的葉綠素發(fā)射峰一致。

白色一品紅葉片樣品的熒光光譜(圖5)與紅色葉片樣品具有相似的發(fā)射峰(675.63 nm和726.28 nm)，但每個發(fā)射峰的強度更大。

圖6：三種樣品的熒光光譜對比圖

紅色一品紅樣品(紅色線)，綠色一品紅樣品(綠色線)，白色一品紅樣品(藍(lán)色線)

圖6為紅色一品紅樣品(紅色線)、綠色一品紅樣品(綠色線)和白色一品紅樣品(藍(lán)色線)的熒光光譜比較。為了直接比較每個樣品的葉綠素含量，計算735 nm和700nm峰值的比。紅葉樣本，兩個峰的比值為7492.67/26998.33，等于0.278。對于綠葉樣本，比值為44973.55/53473.00，即0.841。白葉樣本的比值為13650.20/44659.54，即0.306。

綜上所述，紅葉和白葉樣品相比，綠葉樣品中的葉綠素濃度要高得多。此外，紅葉和白葉樣本的葉綠素濃度相似，盡管白葉樣本比紅葉樣本看起來更綠。

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